液相色譜柱的系統由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統,樣品溶液經進樣器進入流動相,被流動相載入色譜柱(固定相)內,由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數,在兩相中作相對運動時,經過反復多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動速度上產生較大的差別,被分離成單個組分依次從柱內流出,通過檢測器時,樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀,數據以圖譜形式打印出來。
　　
　　液相色譜柱的選擇
　　
　　一、聚合物填料
　　
　　聚合物填料多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要優點是在PH值為1—14均可使用。相對于硅膠基質的C18填料，這類填料具有更強的疏水性；大孔的聚合物對蛋白質等樣品的分離非常有效。現有的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質填料，色譜柱柱效較低。三、其它無機填料其它HPLC的無機填料色譜柱也已經商品化由于其特殊的性質，一般于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠基質烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎，不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合相硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強。石墨化碳可用于分離某些幾何異構體，由于在HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可以用于HPLC。氧化鋁微粒剛性強，可制成穩定的色譜柱柱床，其優點是可以在PH高達12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用也很強，應用范圍受到一定限制，所以未能廣泛應用。新型色譜氧化鋯基質填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應用PH1-14，溫度可達100℃。由于氧化鋯填料是zui近幾年才開始研究，加之面臨的實驗難度，其重要用途與優勢尚在進行之中。
　　
　　二、硅膠基質填料
　　
　　1、反向色譜
　　
　　反向色譜用的填料常是以硅膠為基質，表面鍵合有極性相對較弱官能團的鍵合相。反向色譜所使用的流動相極性較強，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分zui先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強的保留。常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。
　　
　　2、正相色譜
　　
　　正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica）以及其他具有極性官能團胺基團，如（NH2，APS）和氰基團（CN，CPS）的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他極性基團極性較強，因此，分離的次序是依據樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份zui先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如正已烷（Hexane），氯（Chloroform），二氯甲烷（MethyleneChloride）等。